III - Matériel et méthodes
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1. Choix des substances à tester

Nous avons choisi des ingrédients de médicaments, de cosmétiques, des additifs alimentaires et des pesticides. Les substances ont été sélectionnées sur deux critères : leur présence persistante dans notre environnement proche (alimentation, cosmétiques) et les risques cancérigènes et/ou neurotoxiques soupçonnés, principalement d’après les structures chimiques des substances (évaluation par QSAR*) ou suite à une exposition accidentelle (cas des pesticides).

	Substance	N° CAS	Liste prioritaire	Utilisation
1	1,4 Dioxane	123-91-1	LP2	Solvant utilisé dans des domaines très variés (peintures, vernis, détergents, cométiques, insecticides et herbicides, industrie du caoutchouc…) Agent d’extraction des huiles animales et végétales, solvant
2	2 Butoxyéthanol	111-76-2		Solvant des cosmétiques. Laques, vernis. Utilisé pour fabriquer des esters d’acétate comme les phtalates
3	3 Aminophénol	591-27-5		Utilisé dans les colorations pour cheveux et dans la production pharmaceutique
4	4 Aminobiphenyl	92-67-1		Intermédiaire dans les teintures Utilisé dans la recherche sur le cancer comme agent carcinogène
5	Abamectine	71751-41-2		Acaricide - insecticide de la famille des avermectines - vermifuge (vétérinaire). C’est un insecticide. Très persistant, il inhibe les synapses* GABAnergiques*chez l’insecte.
6	Acetaminophène	75-05-8	LP1	Matière première pour la fabrication de substances chimiques (produits pharmaceutiques, pesticides et produits photographiques) Solvant utilisé dans divers procédés de l’industrie chimique et des laboratoires de recherche
7	Acétonitrile	75-05-8	LP1	Matière première pour la fabrication de substances chimiques (produits pharmaceutiques, pesticides et produits photographiques) Solvant utilisé dans divers procédés de l’industrie chimique et des laboratoires de recherche
8	Acide benzoïque	65-85-0		E 210, conservateur présent dans les aliments Utilisé comme un absorbant d’UV dans les plastiques
9	Acrylamide	79-06-1	LP1	Utilisé dans le traitement des eaux Réactif et composant dans la production de composés organiques
10	Aldicarb	116-06-3		Insecticide, acaricide, nématicide utilisé dans les fruits et légumes
11	Aldrine	309-00-2		Insecticide du sol et du coton
12	Benzophénone 3	2835-78-1		Cosmétiques (produits solaires), médecine et industrie (fixateur de couleurs)
13	Bisphénol A	80-05-7	LP3	Fabrication de polymères (PVC), de résines (résine époxy) Retardateurs de flamme, fongicide
14	Carbaryl	63-25-2		Insecticide pour les utilisations non agricoles, médicaments vétérinaires
15	Chlorpyriphos	2921-88-2		Acaricide et traitement du maïs, des maisons Insecticide utilisé contre les moustiques, dans le stockage des denrées. Sur les animaux
16	Dicofol	115-32-2		Acaricide de la famille des carbinols, anti-mites. Sur les cultures
17	Ethylène glycol	107-21-1		Antigel pour les systèmes de refroidissement Solvant Utilisé dans l’industrie pharmaceutique, extraits alimentaires et les essences, lotions pour le visage, poudres (cosmétiques)…
18	Fénazaquine	120928-09-8		Acaricide et insecticide
19	Fipronil	120068-37-3		Insecticide pour les animaux et les cultures
20	Heptachlore	76-44-8		Insecticide pour le coton, graines, Contre les termites, moustiques et mouches
21	Lindane	58-89-9		Insecticide dans le traitement des graines, ectoparasites des animaux. Chez le chat, pédiculicide, scabicide, ectoparasite
22	Metoxychlore	72-43-5		Insecticide (moustiques, mouches) organochloré, de la famille du DDT. Très persistant dans le sol. Chez le chat, ectoparasite
23	Paraquat	1910-42-5		Herbicide de contact
24	Perméthrine	52645-53-1		Insecticide de la famille des pyrèthres, nématicide, acaricide très persistant, son action est foudroyante sur la transmission axonale* chez l’insecte
25	Phosmet	732-11-6		Insecticide cultures diverses et variées
26	Propylparabene	94-13-3		Conservateur E214 dans les aliments, présent aussi dans les produits cosmétiques, dans de nombreux médicaments Il est employé comme germicide
27	Quinoléine	91-22-5		Colorant jaune E104 (aliments, etc.) interdit aux Etats-Unis, suspecté d’avoir des effets mutagènes Fabrication de produits organiques, fabrication de colorants
28	Roténone	83-79-4		Acaricide, insecticide, très toxique pour les poissons

2. Choix des lignées cellulaires

Puisque nous nous intéressons à l’évaluation des risques toxiques chez l’Homme, nous avons utilisé des lignées cellulaires* humaines. Le choix des produits soumis aux tests a également déterminé le choix des lignées cellulaires, sélectionnées en fonction des organes et tissus les plus susceptibles d’être les cibles de ces substances. Le premier organe concerné dans notre organisme par la toxicité est le foie.

HepG2 est une lignée dérivée d’un hépatocarcinome, utilisé couramment dans des études de biochimie et de biologie cellulaire du foie.

SHSY 5Y est une lignée dérivée d’un neuroblastome*, également très étudiée comme modèle neurocellulaire.

Ces lignées sont établies*, c'est-à-dire immortelles* et transformées*. Il est bien connu que les cellules tumorales* ont perdu certaines caractéristiques des cellules normales dont elles sont dérivées et en ont acquis d’autres. Les lignées retenues ont cependant gardé les caractères biologiques essentiels pour nos objectifs.

3. Choix des gènes

Notre choix a été guidé par l’objectif de déceler les potentiels pathologiques* des substances.  51 gènes ont été sélectionnés dans une liste initiale de 1 100 gènes humains dont les activités sont connues, en présence d’une substance pour :

Ces 51 gènes ont été regroupés en 6 familles, selon les pathologies dans lesquelles ils interviennent préférentiellement. Les gènes d’une même famille sont donc des marqueurs de voies pathologiques. Beaucoup de ces gènes interviennent dans deux ou plusieurs des 6 voies pathologiques.

La liste des gènes et les connaissances actuelles sur leur fonction sont présentées en annexe.

Famille des marqueurs du stress cellulaire*

Les marqueurs de stress cellulaire sont les acteurs essentiels de protection de la cellule contre des agressions aiguës. Une substance dérégulant leur expression a donc une (ou plusieurs) activité toxique dommageable ou fatale pour la cellule, à court comme à long terme.

9 gènes, dont :

Famille des marqueurs du dommage à l’ADN

9 gènes, dont :

Famille des marqueurs du cycle cellulaire (division/prolifération)

8 gènes, dont :

Famille des marqueurs de la neurotoxicité*

Il s’agit de 8 gènes intervenant (mais pas exclusivement) dans la transmission neuronale et dans la mise en place du système nerveux (ACHE, CTSB, DRD2, BZRP, TH, THBS1, HOXD1, ROBO1).

Famille des marqueurs de la réponse hormonale*

Il s’agit de 10 gènes dont l’expression est sous contrôle hormonal (TFF1, CTSD, PGR, RAN, AR, CREB1, ESR1, CALR, CYP19A1, ALB)

Famille de marqueurs impliqués dans le contrôle de conformation (ou de l’architecture) et dans l’organisation des protéines

Défaillants dans une importante famille de maladies (Alzheimer, Parkinson, diabète de type II, certains cancers, peut-être sclérose en plaques…).

Il s’agit de 6 gènes (HSPA5, XBP1, ATF6, ERN1, C12orf8, A2M)

4. Exposition des cellules aux substances

Chaque lignée cellulaire a été cultivée à confluence* puis exposée à deux concentrations de la substance à tester pendant deux temps.

La concentration la plus élevée, C1, est celle qui inhibe la culture à 50 % (IC50*). La concentration la plus faible, C2 est égale à C1/10 sauf pour deux substances : l’acrylamide et l’acide benzoïque, où C2 est différent de C1/10 (tableau 2).

IC50 a été établie pour chaque substance au préalable.

Le temps d’exposition le plus court, T1, est de 24 heures ; le plus long - T2 - est de 48 heures.

Le foie est le principal organe de métabolisation des substances pénétrant le circuit sanguin. Les autres tissus et organes sont donc largement exposés à la substance et en sus aux métabolites* produits par le foie. Pour se rapprocher le plus possible des conditions physiologiques*, à la fin de chaque expérience sur les cellules hépatiques HepG2, nous avons pris le milieu surnageant de ces cellules comme milieu de culture pour les cellules neuronales SH SY5Y dans les mêmes conditions de temps d’exposition. Les cellules neuronales ont donc été exposées à la fois à la substance à tester et à ses métabolites produits par HepG2.

Tableau 2 : Concentrations utilisées pour chaque substance testée

	Substance	N° CAS	C1	C2
1	1,4 Dioxane	123-91-1	76,2 mM	7,62 mM
2	2 Butoxyéthanol	111-76-2	26 mM	2,6 mM
3	3 Aminophénol	591-27-5	860 µM	86 µM
4	4 Aminobiphenyl	92-67-1	591 µM	59,1 µM
5	Abamectine	71751-41-2	47,76 µM	4,776 µM
6	Acetaminophène	103-90-2	2,72 mM	0,272 mM
7	Acétonitrile	75-05-8	736 mM	73,6 mM
8	Acide benzoïque	65-85-0	24,5 mM	3,14 mM
9	Acrylamide	79-06-1	1,61 mM	0,322 mM
10	Aldicarb	116-06-3	2,6 mM	0,26 mM
11	Aldrine	309-00-2	67 µM	6,7 µM
12	Benzophénone 3	2835-78-1	422,5 µM	42,25 µM
13	Bisphénol A	80-05-7	200 mM	20 mM
14	Carbaryl	63-25-2	0,26 mM	0,026 mM
15	Chlorpyriphos	2921-88-2	75 µM	7,5 µM
16	Dicofol	115-32-2	5,125 µM	0,5125 µM
17	Ethylène glycol	107-21-1	555 mM	55,5 mM
18	Fénazaquine	120928-09-8	105,3 µM	10,53 µM
19	Fipronil	120068-37-3	0,1 mM	0,01 mM
20	Heptachlore	76-44-8	59 µM	5,9 µM
21	Lindane	58-89-9	0,41 mM	0,041 mM
22	Metoxychlore	72-43-5	20 µM	2 µM
23	Paraquat	1910-42-5	0,54 mM	0,054 mM
24	Perméthrine	52645-53-1	0,327 mM	0,0327 mM
25	Phosmet	732-11-6	44,12 µM	4,412 µM
26	Propylparabene	94-13-3	0,36 mM	0,036 mM
27	Quinoléine	91-22-5	500 µM	50 µM
28	Roténone	83-79-4	0,13 µM	0,013 µM

Figure 1. Schéma illustrant la stratégie d’exposition des cultures à la substance testée

Légende figure 1