One Voice : Comment mettre fin aux tests de toxicité sur animaux ?

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Comment mettre fin aux tests
de toxicité sur animaux ?

Un rapport du Docteur
Gill Langley MA Phd (CANTAB), MIBiol, Cbiol

Automne 2001

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V - TESTS : PROPRIÉTÉS MUTAGÈNES & PROPRIÉTÉS CARCINOGÈNES
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	TEST DE PROPRIÉTÉS MUTAGÈNES
Animal	rats, souris ou hamsters chinois. -
Nombre	au moins 40. -
Objectif	identifier d'éventuels effets mutagènes de la substance chimique, soit sur les cellules en division rapide de la moelle osseuse, soit sur les noyaux des cellules sanguines. -
Test	La substance à tester est administrée soit par voie orale soit par injection dans la cavité abdominale. Pour chaque substance testée et pour chaque dosage, on utilise deux groupes témoins. L'un des deux groupes ne reçoit aucun produit, l'autre reçoit un composé que l'on sait avoir un effet sur les gènes. On administre des doses simples ou multiples, et l'on prélève des échantillons de tissu jusqu'à 48 heures après l'administration de la dose. -
Symptômes	les animaux subissent une ou plusieurs injections dans la cavité abdominale, ce qui peut être douloureux. On cherche à aboutir finalement à des modifications au niveau des gènes. -

	TEST DE PROPRIÉTÉS CARCINOGÈNES
Animal	rats ou souris très jeunes. -
Nombre	au moins 400. -
Objectif	détecter toute manifestation de cancer résultant de l'exposition à une substance chimique. -
Test	L'administration de la substance se pratique aussitôt que possible après l'acclimatation de l'animal. L'administration se fait habituellement par voie orale, mais elle peut aussi se faire par voie cutanée (on enduit l'épiderme) ou par inhalation. Le choix se fait selon le désir d'imiter la manière dont un être humain pourrait se trouver exposé à la substance. L'évaluation de la dose toxique minimale se fait en fonction du poids de l'animal, et la dose maximale est celle qui provoque une baisse du poids marginal sans induction de tumeur. L'effet de l'exposition à la substance est évalué par le biais d'une analyse de sang, de l'examen de l'apparence pathologique et des tissus et des organes, afin de détecter des changements liés à l'apparition de cancers. De tels tests peuvent coûter 2 millions de dollars par substance et durer cinq ans. -
Symptômes	tumeurs, léthargie, nausée et même mort de l'animal. -

Critique
Les substances mutagènes sont celles qui provoquent des mutations génétiques. Les mutations constituent souvent une étape dans la formation des cancers. Dans un souci de simplification, nous critiquons en même temps, ci-après, les tests relatifs aux propriétés mutagènes et les tests relatifs aux propriétés carcinogènes bien que ce que subissent les animaux ne soit pas comparable entre ces deux types de tests, les critiques que l'on peut formuler sont les mêmes d'un point de vue scientifique, dans la mesure où les substances chimiques qui provoquent des mutations sont souvent celles qui provoquent des cancers.

- Il est maintenant admis que le cancer n'est pas une simple maladie. Les tumeurs, chez l'humain comme chez l'animal, surviennent en principe comme conséquence de divers événements, dont un seul peut être une simple exposition à une substance chimique - et ceci n'est pas pris en compte dans les expérimentations effectuées sur les animaux pour établir les propriétés mutagènes ou carcinogènes.

- Les critiques faites aux tests de toxicité s'appliquent aussi pour une grand part aux tests des propriétés mutagènes, plus particulièrement en ce qui concerne l'état du système immunitaire de l'animal expérimenté et les inconnues qui pèsent sur son hérédité.

- A moins de connaître en détail la biochimie de la substance testée chez l'espèce utilisée et chez l'être humain, on ne sait pas clairement s'il y a ou non pénétration de la substance dans la moelle osseuse, ainsi des résultats négatifs peuvent-ils être observés et induire en erreur (24 & 25).

- Du fait des difficultés possibles de la substance testée à pénétrer dans la moelle osseuse, on recourt à des doses massives (en général la plus forte dose tolérée). Cela rend l'extrapolation à une autre espèce et à l'être humain douteuse en termes d'exposition probable.

- L'injection des substances à tester dans la cavité abdominale n'est pas un mode d'administration approprié lorsqu'il s'agit de simuler l'exposition à une série de substances chimiques. Combes a mis en évidence les divers problèmes que pose la mise en œuvre de ce test de propriétés mutagènes pour les cosmétiques (26).

- Pour bien des substances chimiques potentiellement mutagènes, la moelle osseuse a peu de chances d'être le tissu à cibler en priorité (26).

- La vitesse du métabolisme varie avec la taille de l'organisme. Les rats et les souris sont des espèces à métabolisme élevé par rapport à l'être humain (27).

- Un certain nombre de substances chimiques présentes dans l'organisme jouent le rôle d'"éboueurs" naturels. Elles éliminent toute molécule potentiellement dangereuse qui se présente ou qui est ingérée. La vitesse d'action de l'une d'entre elles, la glutathione, chez différents animaux, rend périlleuses les comparaisons des dommages cellulaires probables lorsque l'on veut évaluer une substance dangereuse du point de vue génétique (28).

- On sait que les dégâts génétiques aussi bien que la carcinogenèse sont en relation avec les effets d'une forme d'oxygène hautement active (29), et chez nombre d'animaux utilisés pour l'évaluation du potentiel carcinogène et mutagène, les mécanismes de réparation de l'ADN sont bien plus sommaires que chez l'être humain (30). Il n'est donc pas surprenant que les petits rongeurs soient plus enclins à développer des cancers que l'être humain (31), et les comparaisons deviennent de simples suppositions (14).

- Le régime alimentaire des humains n'est généralement pas limité, il est donc nettement plus riche en anti-oxydants naturels et synthétiques que celui des "modèles" animaux, il s'ensuit que les animaux de laboratoire sont beaucoup plus enclins à développer divers cancers (32).

- Au cours de leur existence, les humains sont exposés à un certain nombre de carcinogènes potentiels, à diverses doses et sous diverses combinaisons. En situation de test, au contraire, on administre à l'animal une substance unique, et la réaction toxicologique peut varier selon que celui-ci reçoit une dose simple ou multiple, même s'il s'agit toujours de la même substance chimique (33). C'est pourquoi il est pour le moins hasardeux de vouloir extrapoler les résultats à la situation complexe qui est celle des personnes dans leur vie quotidienne et professionnelle.

- L'état physiologique et immunitaire du "modèle" animal est déterminant par rapport au résultat de toute procédure de test. Des variations d'un animal à l'autre, en ce qui concerne le régime alimentaire, l'état diabétique, l'absorption de graisse, le traumatisme et le stress, ainsi que les conditions d'hébergement, se traduiront par des différences dans les résultats des tests (34).

- Il existe une série de différences entre l'être humain et les rongeurs, au niveau de la plupart des enzymes du foie qui métabolisent les produits administrés, comme le cytochrome P450s. Les conséquences ne sont pas neutres vis-à-vis du potentiel de carcinogenèse de diverses substances chimiques. Par ailleurs, les formes de P450s que l'on trouve chez l'être humain sont liées au régime alimentaire, à la constitution génétique, à la consommation de tabac et d'alcool, ainsi qu'aux conditions d'exposition aux facteurs environnementaux (14).

- Les variations observées d'une espèce à une autre et d'une lignée à une autre, chez les rongeurs, indiquent que le cheminement de nombreuses substances chimiques nocives dans l'organisme n'est pas simple à appréhender. Mani et al (35) ont montré que les effets du benzène, potentiellement toxique et inducteur de tumeurs à faibles doses, varient considérablement entre différentes lignées endogames de souris appartenant à une espèce couramment utilisée dans les laboratoires. Chez le rat de Fischer, les résultats observés sont encore différents. Les différences de résultats se sont révélées dépendre des facultés métaboliques propres à chaque lignée et à chaque espèce. L'étude des amines hétérocycliques (une molécule organique carcinogène communément répandue, qui se forme au cours de divers procédés de cuisson) conduit aux mêmes conclusions. Turteltaub et al (36) ont découvert que ces amines provoquaient des dégâts génétiques chez les rongeurs, et davantage encore chez les humains exposés aux mêmes doses. Par ailleurs, ils ont relevé des différences substantielles entre l'humain et le rat dans les métabolites de l'administration d'amine. Ces auteurs ont conclu qu'au vu des résultats, les "modèles" rongeurs ne reflétaient pas de manière adéquate la réaction de l'être humain à l'exposition aux amines hétérocycliques (36). Dans leur étude publiée en 1999, Garner et al sont arrivés aux mêmes conclusions (37).

- L'organisme humain a tendance à stocker dans les tissus graisseux un certain nombre de substances chimiques solubles nocives, comme les polychlorobiphényles (PCB), la diffusion des toxines se produisant au cours du métabolisme. Chez le rat, l'organisme a recours à un procédé d'élimination des toxines tout à fait différent, qui consiste à stocker et à décomposer (enzymes de désaturation).

- On constate même des différences de résultats d'un laboratoire à un autre, dans des tests portant sur les mêmes substances chimiques, que l'on soupçonne d'être cancérigènes, et pratiqués sur les mêmes lignées de rongeurs.

- La réaction observée lors du test d'une substance peut varier selon le mode d'administration.

- Le potentiel d'une substance chimique quelconque à déclencher une tumeur varie aussi selon l'espèce. Chez le rat, on a montré que l'administration de saccharine provoquait le cancer de la vessie, et il apparaît qu'une protéine agissant dans une urine alcaline y serait pour quelque chose. Cette protéine n'existe pas chez l'être humain, et l'urine humaine est en principe acide (38).

- Lorsque l'on compare les réactions à ces tests chez le rongeur et chez l'être humain, le fait que l'on trouve des résultats positifs et négatifs faux complique les choses. Les tests sur les rongeurs aboutissent fréquemment à classer par erreur des substances chimiques comme carcinogènes, alors qu'elles ne le sont pas, et inversement.

- Les tests de propriétés carcinogènes, menés sur les animaux, sont coûteux à la fois en temps et en argent, et comme cela a été montré, ces inconvénients ne sont pas compensés par une fiabilité appréciable des résultats.

- On observe de nettes différences en fonction de l'âge, aussi bien à l'intérieur d'une espèce que d'une espèce à une autre, dans les réactions aux substances chimiques potentiellement carcinogènes ou mutagènes.

- Il a été montré que les restrictions alimentaires chez les jeunes souris retardent l'apparition des tumeurs en réaction à un test concernant une substance soupçonnée d'être carcinogène (39 & 40). La transposition de ce phénomène à l'être humain n'est pas évidente.

- Les effets de l'absorption d'une substance chimique, quelle qu'elle soit, sont très variés selon les espèces. Le caractère létal est variable d'une lignée à une autre. Ainsi, par exemple, les taux d'absorption cutanée peuvent varier du simple au quintuple entre l'être humain et les autres espèces. La peau humaine est moins perméable que celle des rongeurs à bien des substances chimiques - de tels résultats, en termes d'absorption, aboutissent donc à surestimer les risques de tumeurs (41). Des différences essentielles, observées dans les cas d'absorption avec la nourriture, peuvent être reliées à des différences significatives en termes d'anatomie du système gastro-intestinal entre les diverses espèces (42).

Stratégie alternative

Propriétés mutagènes

On estime à un cinquième la proportion des produits chimiques couramment répandus dans le commerce à présenter des propriétés mutagènes (43). Les mutations d'origine chimique peuvent entraîner des cancers ou des malformations congénitales.

Il existe plusieurs méthodes validées, autorisées et utilisées depuis plus de 20 ans en toxicologie, de façon officielle, permettant de tester in vitro les propriétés mutagènes. Ces méthodes figurent depuis longtemps dans les directives de tests de l'OCDE ainsi que dans l'annexe correspondante du côté de l'Union Européenne. Elles sont indiquées pour l'évaluation des substances chimiques simples comme pour celle des mélanges, et permettent également d'identifier les métabolites mutagènes.

L'agence américaine pour la protection de l'environnement accepte les données provenant de deux tests de toxicité génétique in vitro, sans tests in vivo, dans le cadre du programme américain de production chimique à grand volume (High Production Volume Chemical Challenge Program)(44).

Stratégie de tests par étapes pour les propriétés mutagènes

Etape 1 :
Les relations structure/activité et les systèmes sur ordinateur tels que DEREK, COMPACT (Computer Optimised Molecular Parametric Analysis for Chemical Toxicity - Analyse paramétrique moléculaire de la toxicité chimique optimisée sur ordinateur) et TOPKAT (Toxicity Prediction by Computer-Assisted Technology - Prédiction de toxicité par technologie assistée par ordinateur) permettent d'identifier les substances potentiellement mutagènes.

Etape 2 :
Les substances chimiques sont testées selon les trois méthodes in vitro normalisées et acceptées : le test d'Ames, les tests de mutation des cellules de mammifères et les tests d'aberration chromosomique, avec et sans activation métabolique.
Trois résultats positifs caractérisent les substances chimiques mutagènes et trois résultats négatifs indiquent l'absence de propriété mutagène. En cas de résultats contradictoires, on passe à l'étape 3.

Etape 3 :
Les substances chimiques ayant donné des résultats contradictoires à l'étape 2 peuvent être soumises à des tests supplémentaires moyennant des modifications de la procédure ou le recours à d'autres méthodes (comme le test micronucléaire in vitro, actuellement en cours de validation au Japon, en Europe et aux Etats-Unis, ou bien la procédure COMET).
Le risque réel que représentent les substances chimiques identifiées lors de ces tests peut être estimé à l'aide de techniques de modélisation sur ordinateur (voir Encadré 2).

Une telle stratégie permet de déterminer si les substances chimiques comportent ou non des risques de provoquer des mutations.

Perspectives

Action à mener en priorité

La Commission européenne devrait obtenir un avis définitif de l'ECVAM concernant le meilleur choix des tests de l'étape 3. Le test micronucléaire in vitro est actuellement en cours de validation. La Commission européenne devrait faire de cela une priorité et mettre ce test en application dès sa validation.

Délai suggéré : 1 an.

Stratégie alternative

Propriétés carcinogènes

De nombreuses substances carcinogènes provoquent le cancer par le biais de mutations de l'ADN, et il est possible d'identifier tout d'abord ces mutations grâce à des tests in vitro officiellement acceptés (voir stratégie pour les propriétés mutagènes). Cependant, une fois éliminé les substances chimiques mutagènes, il existe d'autres effets de substances chimiques susceptibles d'aboutir à la formation de tumeurs, et c'est là que s'impose une stratégie de tests permettant d'identifier les propriétés carcinogènes.

Il serait souhaitable d'associer la modélisation sur ordinateur de l'absorption, de la diffusion et de l'élimination des substances dans l'organisme (voir Encadré 2) avec des études in vitro du métabolisme.

Stratégie de tests par étapes pour les propriétés carcinogènes

Etape 1 :
Les propriétés fondamentales d'une substance chimique, parmi lesquelles le coefficient de division ou la constante de dissociation, ont un rapport direct avec la carcinogenèse. Mentionnons aussi les signaux structurels et les relations structure/activité entre les structures moléculaires et les propriétés carcinogènes. Le recours à la modélisation sur ordinateur et aux systèmes experts est ici très utile (voir Encadré 2).

Etape 2 :
Les tests de transformation cellulaire tels que le SHE (Syrian hamster embryo -embryon de hamster de Syrie) (voir Encadré 3) ont été officiellement acceptés par l'agence internationale pour la recherche sur le cancer ainsi que par un groupe de travail de l'ECVAM.

Etape 3 :
Les substances chimiques ayant donné des résultats contradictoires à l'étape 2 et aux tests concernant les propriétés mutagènes (voir plus haut) peuvent être soumises à des études complémentaires in vitro, comme par exemple le test de communication intercellulaire (48).

Une telle stratégie permet d'identifier les substances chimiques présentant un risque de
carcinogenèse, ainsi que celles qui ne présentent pas de risque de provoquer des tumeurs.

Perspectives

Action à mener en priorité

La Commission européenne devrait promouvoir et mettre en place une telle stratégie au nom du principe de précaution, à savoir que lorsque le risque de carcinogenèse est mis en évidence, la substance chimique concernée devrait faire l'objet d'un contrôle approprié ou être retirée de la circulation. Il serait souhaitable de donner la priorité à la validation finale et à l'acceptation du test de transformation cellulaire SHE de l'étape 2, ainsi qu'à la validation du test de communication intercellulaire si l'avis de l'ECVAM va dans ce sens.

Délai suggéré : 2 ans.

Encadré 2 - Modélisation sur ordinateur et systèmes experts

Il existe un certain nombre de logiciels permettant d'observer la structure d'une substance chimique, d'examiner ses propriétés et de les extrapoler pour en prédire le comportement dans l'organisme humain.

Les systèmes disponibles actuellement sont les suivants :

- DEREK (Deductive Estimation of Risk from Existing Knowledge - Estimation déductive du risque en fonction du savoir actuel)
- COMPACT (Computer Optimised Molecular Parametric Analysis for Chemical Toxicity - Analyse paramétrique moléculaire de la toxicité chimique optimisée sur ordinateur)
- TOPKAT (Toxicity Prediction by Computer-Assisted Technology - Prédiction de toxicité par technologie assistée par ordinateur)
- HazardExpert

TOPKAT a fait l'objet d'une utilisation récente par l'agence américaine pour la protection de l'environnement à propos des propriétés carcinogènes probables de substances chimiques destinées à la désinfection de l'eau (45).

COMPACT permet d'évaluer la probabilité qu'une substance chimique interagisse avec les enzymes du foie et évolue à travers le métabolisme vers une forme carcinogène (27).

HazardExpert est un logiciel qui reconnaît les structures carcinogènes dans les molécules des substances chimiques. En associant COMPACT et HazardExpert, on a pu identifier correctement 85 pour cent de 40 substances chimiques et médicaments, carcinogènes et non carcinogènes (27).

La modélisation bio-cinétique fondée sur la physiologie est particulièrement bien adaptée aux études de toxicité. Les modèles PBBK permettent de prédire l'absorption, le métabolisme, la diffusion dans l'organisme et l'élimination de la substance, au niveau de l'ensemble de l'organisme. On peut réaliser des prédictions d'après les données normalisées publiées sur les diverses parties de l'organisme en y associant l'information provenant des études cellulaires in vitro.

Encadré 3 - Le test de transformation SHE

Lorsque les cellules subissent une "transformation", elles deviennent cancéreuses. Ce test s'effectue sur des cellules d'embryon de hamster de Syrie en éprouvette et sa durée est de quelques jours. Soixante-quinze substances chimiques préalablement testées sur des rats et des souris ont été soumises au test SHE, afin de voir si ce test permettait de distinguer de faire le tri, de façon adéquate, entre les substances carcinogènes et les substances non carcinogènes. Les résultats furent semblables à ceux obtenus sur les rongeurs dans 83 pour cent des cas, ce qui représente une très bonne performance (46).

Une étude complémentaire a été menée sur 19 substances chimiques, à l'initiative de l'Institut international des sciences de la vie. Dans cette étude, publiée en 2001, le taux de concordance avec les résultats obtenus sur les rongeurs était de 89 pour cent.

Le test SHE a été proposé à l'OCDE, et des directives ont été tracées en 1996. Les choses n'ont cependant pas beaucoup avancé depuis. Pourtant, aux Etats-Unis, la Food and Drug Administration reconnaît déjà la validité des tests de transformation cellulaire dans la recherche pharmaceutique.

En 1999, un groupe de travail de l'ECVAM a publié un rapport sur les tests de transformation cellulaire pour la prédiction de la carcinogenèse (47). Selon ce rapport :
- Les tests de transformation ont été adoptés par la prestigieuse Agence internationale pour la recherche sur le cancer pour leur adéquation, du point de vue biologique, dans l'étude de la carcinogenèse, et en tant qu'approche cohérente pour la prédiction du potentiel carcinogène des substances chimiques.
- Le test de transformation SHE peut être hautement prédictif pour la carcinogenèse.
- En cas de résultat positif au test d'Ames et au test SHE, "il devrait être tenu pour acquis que la substance chimique considérée est carcinogène pour les rongeurs".
- On peut légitimement se demander pourquoi les instances officielles ont fait si peu de cas des tests de transformation cellulaire.
- Il serait souhaitable de donner dès à présent la priorité à une étude de validation de ces tests. Il faut que la meilleure méthode d'application de ces tests soit normalisée.

Le test SHE apparaît clairement comme particulièrement indiqué pour l'identification des substances chimiques inductrices de cancers. Une validation finale et une standardisation du protocole de test s'imposent, et un laps de temps de deux ans suffirait pour ce faire.
Associée à des tests de propriétés mutagènes in vitro selon une procédure déjà reconnue officiellement, la méthode de test SHE permettrait d'identifier rapidement les substances susceptibles d'être carcinogènes pour l'être humain, dans des délais qui se comptent en jours ou en semaines plutôt qu'en années. Par la même occasion, des milliers d'animaux seraient ainsi épargnés.