One Voice : Comment mettre fin aux tests de toxicité sur animaux ?

Comment mettre fin aux tests
de toxicité sur animaux ?

Un rapport du Docteur
Gill Langley MA Phd (CANTAB), MIBiol, Cbiol

Automne 2001

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IV - TEST : TOXICITÉ AIGÜE ET TOXICITÉ À DOSES RÉPÉTÉES

	TEST DE TOXICITÉ AIGÜE
Animal	rats en général -
Nombre	15 à 30 par substance testée, selon le protocole et le mode d'administration (oral, cutané ou par inhalation). -
Objectif	évaluer les effets toxiques sur l'ensemble de l'organisme d'une dose unique d'une substance chimique. -
Test	Les animaux sont gardés sur place pendant un minimum de cinq jours pour qu'ils s'acclimatent. La période d'observation et normalement de 14 jours, et en cas d'administration orale les animaux sont préalablement attachés. Tous les animaux sont autopsiés à la fin de la période de test. Toute réaction spécifique au sexe de l'animal est consignée. -
Symptômes	variations de la pression artérielle, perte de poids, salivation excessive, lésions internes des organes, perturbations respiratoires, convulsions, saignements des yeux, du nez ou de l'anus, érection du pelage, tremblements, diarrhée, coma,voire mort de l'animal. -

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Critique

Les critiques relatives aux tests de toxicité aiguë s'appliquent aussi aux tests de toxicité à doses répétées, et vice versa.

- L'état du système immunitaire et physiologique ainsi que le sexe, les caractéristiques génétiques et autres indicateurs de l'état de santé de l'animal exercent une influence sur les résultats du test. De même, le fait que l'animal ait pu être exposé à d'autres substances chimiques et les différents cas de figure génétiques des animaux dont on ignore l'ascendance sont autant de facteurs de variabilité des résultats.

- Il existe un certain nombre de différences significatives entre les espèces quant au rôle que jouent les organes dans l'élimination des toxines et quant à la localisation de leur accumulation. On peut observer des différences à propos du profil enzymatique P450 (dans le foie), et l'élimination des substances par les reins ne se fait pas de la même manière ni à la même vitesse ou au même degré chez les animaux testés que chez l'être humain (14).

- Les modes d'administration sont aussi une variable importante, et induisent de larges variations entre les espèces testées et même entre les laboratoires. Le temps nécessaire à l'organisme pour éliminer une substance donnée varie non seulement d'une espèce à une autre mais même d'une lignée à une autre au sein de la même espèce.

- On observe des variations dans le degré d'élimination des toxiques et dans le métabolisme chez différents animaux. Les voies d'élimination privilégiées par l'organisme et la manière dont évolue la substance à l'intérieur de l'organisme (les bio-transformations) varient considérablement (16, 17 & 18).

- La réaction avec les protéines dans le flux sanguin varie selon l'espèce utilisée ainsi que selon la lignée au sein d'une même espèce, les fortes doses aussi bien que les doses répétées donnent des résultats variables (19).

- On observe également de grandes différences avec le cas de l'être humain, où l'on peut voir des métabolites secondaires se former, être stockées puis éliminées par l'organisme, ce qui n'est pas neutre vis-à-vis du potentiel de toxicité.

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	TEST DE TOXICITÉ À DOSES RÉPÉTÉES
Animal	rats en général ; les chiens peuvent également être utilisés lorsque l'on désire tester sur une seconde espèce. -
Nombre	40 à 80 rats et/ou 32 chiens. -
Objectif	évaluer les effets toxiques sur l'ensemble de l'organisme de l'administration répétée d'une dose d'une substance chimique inférieure à la dose létale. -
Test	On administre régulièrement à l'animal une dose d'une substance chimique, sur une période allant de 28 à 90 jours. L'administration de la substance se fait généralement par voie orale, par gavage, mais elle peut également être faite par voie cutanée ou par inhalation. Ensuite, on tue les animaux pour un examen pathologique et biochimique des tissus. Il arrive que l'on traite un groupe "satellite" de 10 animaux avec la dose la plus forte pendant 28 jours. Cette procédure est censée permettre un point de comparaison pour mesurer les effets des doses plus faibles. -
Symptômes	variations de la pression artérielle, salivation excessive, anémie, agressivité, faiblesse musculaire, perte de pilosité, lésions internes des organes, érection du pelage, vomissements (chez les chiens), tremblements, diarrhée, coma, et parfois mort de l'animal. -

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Critique

Les critiques relatives aux tests de toxicité à doses répétées s'appliquent aussi aux tests de toxicité aiguë, et vice versa.

- La vitesse du métabolisme et de l'élimination d'une substance donnée influe sur la manière dont les doses répétées provoquent une réaction. Ainsi, par exemple, chez certains animaux, mais pas chez d'autres, la substance chimique s'accumule dans l'organisme au cours du temps, ce qui provoque un effet d'intoxication plus prononcé et rend plus compliquée toute extrapolation à l'être humain. Le fait que la substance testée se mêle à divers organes et à divers types de cellules dans l'organisme entraîne des différences, d'une espèce à une autre, dans la diffusion et dans la concentration de la substance toxique au sein des organes internes. L'interprétation de l'effet des doses simples aussi bien que de celui des doses répétées en sera rendue plus problématique, de même que la nécessaire extrapolation à l'être humain.

- Dans les études sur l'exposition à long terme, l'évaluation finale pose de sérieux problèmes (15).

- La réaction avec les protéines dans le flux sanguin varie selon l'espèce utilisée ainsi que selon la lignée au sein d'une même espèce. Les fortes doses aussi bien que les doses répétées donnent des résultats variables (19).

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Stratégie alternative

Toxicité à dose aiguë et à doses répétées

Ces tests consistent à étudier les effets d'une substance chimique à partir du moment où elle pénètre et circule dans l'organisme. Il serait souhaitable de tenir compte des données déjà existantes obtenues sur les animaux et sur les humains (par exemple dans les archives des centres anti-poisons, des hôpitaux et des centres spécialisés dans les maladies professionnelles) et de les analyser avant d'envisager de nouveaux tests.

Un groupe de travail de l'ECVAM a publié un programme par étapes pour tester la toxicité aiguë essentiellement à partir de tests substitutifs (20). Ce programme comprend notamment une modélisation informatique bio-cinétique fondée sur la physiologie de l'absorption, de la diffusion et de l'élimination par l'organisme de la substance chimique, ce qui permet d'estimer pour chaque substance la dose probable de sécurité chez l'être humain, lorsqu'elle existe (21).

La propriété prédictive des tests sur des cultures de cellules pour la toxicité à doses répétées, ainsi que pour la toxicité à dose aiguë (dose simple), ne fait plus de doute (22).

Les quatre premières étapes du programme de l'ECVAM sont les suivantes :

Procédure de tests par étapes pour la toxicité à dose aiguë et à doses répétées

Etape 1 :
Information d'ordre physique et chimique sur la substance (constante de dissociation, solubilité dans les graisses, volatilité).
Cela permettrait d'effectuer une comparaison avec les substances dont la toxicité est connue, et aussi de recourir aux techniques assistées par ordinateur pour la prédiction de l'admission et de la diffusion de la substance dans l'organisme.

Etape 2 :
Des tests de base sur des cultures de cellules (cyto-toxicité) permettent d'identifier les substances chimiques qui sont toxiques pour la plupart des cellules par des procédés non spécifiques. [voir encadré 1 pour plus de détails sur le programme MEIC (23)]
Il serait alors possible de classer les substances chimiques hautement toxiques selon les résultats obtenus. Pour les substances chimiques ne se révélant pas toxiques pour les cellules d'une manière générale, on passerait à l'étape suivante.

Etape 3 :
Intégration des données obtenues in vitro, y compris les résultats des études sur le métabolisme, aux simulations sur ordinateur de l'absorption, du métabolisme et de la diffusion dans l'organisme et de l'élimination. On obtiendrait comme résultat une prédiction de la concentration chimique probable et de la vitesse de passage dans les organes cibles.
Les substances chimiques toxiques ayant une forte probabilité de persister dans le flux sanguin sont classées à ce stade. On identifie également les organes cibles.

Etape 4 :
A l'aide des informations obtenues à l'étape 3, des tests cellulaires plus pointus permettent d'identifier la toxicité chimique sélective vis-à-vis de tissus particuliers tels que tissus des reins, tissus neuronaux et cellules vasculaires ou tissus cardiaques.

Là encore, grâce au recours à la modélisation sur ordinateur, on peut classer les substances chimiques sur la base de ces tests. Toute substance chimique pour laquelle les résultats sont négatifs tout au long de la procédure a peu de chances de représenter un danger d'intoxication. Ces études permettent d'établir un "effet de non toxicité" et d'évaluer les doses toxiques.

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Perspectives

Action à mener en priorité

La Commission européenne devrait donner la priorité à la validation du programme MEIC ou des méthodes similaires, surtout en ce qui concerne les tests à doses répétées. Les tests de l'étape 4 relatifs à la toxicité pour les tissus cibles devraient être validés en collaboration avec l'ECVAM.

Délai suggéré : 5 ans maximum.

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Encadré 1 - Programme MEIC

Des scientifiques suédois ont lancé un programme sur sept ans, appelé Evaluation Multi-centre de toxicité cellulaire in vitro (programme MEIC), pour déterminer si des tests in vitro peuvent permettre de prédire la toxicité des substances chimiques sur les humains. Plusieurs dizaines de laboratoires dans le monde ont utilisé les mêmes substances chimiques de référence dans leurs tests in vitro, et les résultats ont été publiés dans une série d'articles (23).

Parmi 61 méthodes expérimentées, une méthode s'est révélée pratique, rentable et hautement prédictive pour la toxicité aiguë chez l'être humain (à travers les mesures des concentrations sanguines critiques obtenues à partir de cas d'empoisonnement aigu chez des humains) : il s'agit d'une combinaison de quatre tests sur des cultures de cellules humaines. Les quatre tests in vitro ont permis de prédire ces résultats sur l'être humain mieux que les tests de dl 50 (dose létale 50%) sur les rats et les souris n'ont permis de prédire les doses létales chez les humains.(1)

Ces quatre tests in vitro sont les suivants :

- Variations du contenu protéique d'une lignée de cellules humaines
- Variations d'ATP dans une seconde lignée de cellules humaines
- Variations de la forme de la cellule, et
- Variations de pH dans une troisième lignée de cellules humaines

Les promoteurs du programme MEIC ont demandé une étude de validation formelle par l'ECVAM de cette sélection de quatre tests. En cas de succès, ces tests sur des cultures de cellules pourraient permettre d'évaluer rapidement et efficacement la toxicité aiguë des substances chimiques pour l'être humain, sans qu'il soit nécessaire de recourir à l'expérimentation animale.

Un groupe de travail de l'ECVAM a recommandé une stratégie de tests par étapes pour classer les substances chimiques selon leur toxicité aiguë. Cette stratégie combine des tests sur des cultures de cellules tels que ceux retenus par le programme MEIC avec des données physico-chimiques. Une seconde série de tests éventuelle, si elle est jugée nécessaire, consisterait à étudier en éprouvette le métabolisme des substances chimiques, à l'aide de cellules hépatiques. Une troisième étape comprendrait des études in vitro sur des cellules spécialisées.
Selon les experts de l'ECVAM, une telle approche, 100% in vitro, permettrait de classer les substances chimiques selon leur toxicité (20). C'est l'ECVAM qui choisirait les meilleurs tests à effectuer pour la seconde et la troisième étapes.

Sur une telle base, il serait possible d'étudier et de classer rapidement et de manière rentable des milliers de substances chimiques existantes, du point de vue de la toxicité aiguë. Les substances pour lesquelles les tests prédiraient une toxicité élevée pourraient alors être mises sous contrôle ou éliminées en vertu du principe de précaution, en attendant une analyse plus complète lorsque des tests in vitro plus approfondis, le cas échéant, seront disponibles.

1 Les concentrations sanguines létales et les doses létales ne sont pas identiques. Les tests in vitro et les tests sur les rongeurs prédisent des mesures légèrement différentes de la toxicité aiguë mais il s'agit dans les deux cas de mesures valides.